Editado por Peter Sarnow, Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford, Universidad de Stanford, California, aprobado el 25 de diciembre de 2020 (revisado el 25 de octubre de 2020)
Reportamos la interacción entre subunidades en la replicación de complejos de transcripción-coronavirus, que son esenciales para la replicación y conservación evolutiva.Proporcionamos evidencia de que el dominio NiRAN asociado con nsp12 tiene actividad transferasa de nucleósido monofosfato (NMP) en trans e identificamos nsp9 (una proteína de unión a ARN) como su objetivo.NiRAN cataliza la unión covalente del resto NMP al extremo amino conservado de nsp9 en una reacción que se basa en iones Mn2+ y residuos Asn conservados adyacentes.Se descubrió que la actividad de NiRAN y la NMPilación de nsp9 son esenciales para la replicación del coronavirus.Los datos nos permiten vincular esta actividad del marcador enzimático del virus anidado con las observaciones previas en la hipótesis de que el inicio de la síntesis de ARN en una clase de virus de ARN es funcional y evolutivamente consistente.
La ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRps) de Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae y otras 12 familias) está vinculada al dominio amino terminal (N-terminal) en la proteína no estructural (nsp) liberada de la poliproteína, llamada NiRAN. 1ab está compuesto por proteasa principal viral (Mpro).Anteriormente, se informó sobre la propia actividad de GMPilación/UMPilación del virus arterial NiRAN-RdRp nsp y se sugirió generar un transitorio para la transferencia de nucleósido monofosfato (NMP) al virus (actualmente desconocido) y/o a la biopolimerización celular.Aquí, mostramos que el coronavirus (Coronavirus humano [HCoV]-229E y Coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo) nsp12 (NiRAN-RdRp) tiene actividad de NMPilación dependiente de Mn2+, que se deriva de nsp9 mediante la formación de nsp9 mediada por Mpro. las nsp flanqueantes N-terminales se liberan proteolíticamente, el fosforamidato se une a la amina primaria (N3825) en el terminal N de nsp9.El trifosfato de uridina es el nucleótido preferido en esta reacción, pero el trifosfato de adenosina, el trifosfato de guanosina y el trifosfato de citidina también son cosustratos adecuados.Los estudios de mutación que utilizaron proteínas recombinantes nsp9 y nsp12 del coronavirus y mutantes HCoV-229E modificados genéticamente determinaron los residuos necesarios para la NMPilación de nsp9 mediada por NiRAN y la replicación del virus en cultivos celulares.Los datos confirmaron la predicción de los residuos del sitio activo de NiRAN y determinaron el importante papel de los residuos de nsp9 N3826 en la NMPilación de nsp9 y la replicación del virus in vitro.Este residuo es parte de la secuencia del tripéptido NNE N-terminal conservada y demostró ser el único residuo invariante de nsp9 y sus homólogos en la familia de los coronavirus.Este estudio proporciona una base sólida para el estudio funcional de la actividad de NMPilación de otros virus anidados y propone posibles objetivos para el desarrollo de fármacos antivirales.
El virus de ARN de cadena positiva de Nidovirales infecta una variedad de vertebrados e invertebrados (1, 2).La orden incluye actualmente 14 familias (3), de las cuales la familia Coronavirus ha sido ampliamente estudiada en los últimos 20 años.En aquel momento, tres coronavirus zoonóticos surgieron de huéspedes animales y provocaron brotes a gran escala de infecciones respiratorias graves en humanos.Incluidas las pandemias persistentes causadas por enfermedades infecciosas agudas graves.Síndrome Respiratorio Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Los nidovirus comparten una organización genómica común, y la subunidad del complejo de replicación-transcripción unido a membrana (RTC) está codificada en los dos tercios del terminal 5-?² y en la subunidad estructural principal de la partícula del virus, así como en algunos accesorios. .Proteína, codificada en el tercio final 3??² del genoma (1).A excepción de una familia de virus planarios (Monoviridae) (8), todos los virus anidados codifican subunidades RTC en dos grandes marcos de lectura abiertos (ORF), ORF1a y ORF1b, que se traducen a partir de ARN genómico.ORF1a codifica la poliproteína (pp) 1a, y ORF1a y ORF1b codifican conjuntamente pp1ab.Con la participación general de la proteasa principal (Mpro) codificada por ORF1a, tanto pp1a como pp1ab se procesan proteolíticamente en una variedad de proteínas no estructurales (nsps), también conocida como 3CLpro, porque tiene homología con la 3Cpro del picornavirus ( 9).Se cree que estos nsps se ensamblan en un gran RTC dinámico, catalizan la síntesis de ARN genómico (replicación) y un conjunto de ARN subgenómico (transcripción) y se utilizan para coordinar la expresión del ORF ubicado aguas abajo de ORF1b (10? ? ?12).
El RTC central incluye la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) (13), la helicasa de la superfamilia 1 (HEL1) (14, 15) y varias enzimas procesadoras de ARN, que están codificadas principalmente en ORF1b y en la familia de los coronavirus. Contiene nsp12-nsp16 y nsp9-nsp12 en la familia Arterioviridae (ver referencia 10ââ 12).RdRp y HEL1 representan dos dominios conservados (una quinta parte) del virus del nido de pájaro y tienen homología con otros virus de ARN.Se cree que la replicasa central está asistida por otras subunidades, incluidas varias nsp pequeñas liberadas de la región carboxi-terminal (C-terminal) de pp1a, aguas abajo de Mpro (coronavirus nsp5 y virus arterial nsp4, respectivamente).Tienen una protección familiar específica limitada y actividades diversas (revisado en la referencia 10ââ12).
Hace relativamente poco tiempo, se encontró un dominio con características de motivo de secuencia únicas en el extremo amino (terminal N) adyacente a RdRp en todos los virus anidados, pero en ningún otro virus de ARN (16).Según su ubicación y actividad de la nucleótido transferasa (nucleósido monofosfato [NMP] transferasa), este dominio se denomina NiRAN (nucleótido transferasa relacionada con Nestvirus RdRp).La combinación de doble dominio de NiRAN-RdRp constituye nsp12 en la familia Coronaviridae y nsp9 en la familia Arterioviridae, y en otros nestoviridae, se espera que NiRAN-RdRp se libere como una nsp independiente de la poliproteína viral.En el coronavirus, el dominio NiRAN contiene ??1/450 residuos y está conectado al dominio RdRp C-terminal a través de la región enlazadora (16?19).En el virus de la arteritis equina (EAV) (Arteriviridae), la nsp9 recombinante muestra actividades de UMPilación y GMPilación (auto) dependientes de iones Mn2+, que dependen de tres bases de secuencia conservadas en nestovirus, AN, BN y CN. Los residuos en la secuencia.Donde N representa NiRAN) (16).El flanqueo N-terminal de estos motivos es un motivo preAN menos conservador.Algunos de estos residuos también se conservan en proteínas quinasas lejanamente relacionadas, donde se ha demostrado que participan en la unión de nucleósido trifosfato (NTP) y en la actividad catalítica (20, 21).De acuerdo con esta observación, varios residuos clave del sitio activo en la pseudoquinasa SelO de Pseudomonas syringae se pueden ensamblar con el supercomplejo SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 publicado recientemente.Residuos conservados de NiRAN de Coronavirus superpuestos en la microestructura electrónica.Proteína recombinante (17).Se especula que la (auto)U/GMPilación documentada producirá un estado transitorio para transferir NMP al sustrato (actualmente desconocido) (16), y la similitud estructural entre NiRAN y la proteína quinasa (17, 19) es la hipótesis de que NiRAN modifica otras proteínas.
Muchas características, incluida su asociación sistemática única y única con virus anidados y la separación genética de RdRp, hacen de NiRAN una enzima reguladora clave razonable para los virus anidados, que es fundamental para su aparición e identidad.Anteriormente, se nombraron tres posibles funciones que involucran a NiRAN para regular la traducción o replicación/transcripción del genoma/subgenómica.Al considerar los escasos e incompletos datos disponibles en ese momento, cada función tiene sus ventajas y desventajas (16).En esta investigación, nuestro objetivo es combinar los estudios bioquímicos y genéticos inversos de los coronavirus que representan los dos géneros, y ubicar nuestros hallazgos en el trasfondo evolutivo de la mutación natural de la familia de los coronavirus, para poder comprender mejor este reino misterioso.Informamos avances importantes en la comprensión de NiRAN a través de la identificación de objetivos naturales en RTC, que (entre las tres hipótesis disponibles) contribuye al papel de este dominio en el inicio de la síntesis de ARN de virus anidado.Esta investigación también abre posibilidades para otras funciones de NiRAN en la interfaz del host del virus.
Para caracterizar las propiedades enzimáticas del dominio NiRAN relacionado con nsp12 del virus corona, produjimos una forma recombinante de nsp12 del coronavirus humano 229E (HCoV-229E) en E. coli, con una etiqueta His6 en el extremo C, y combinamos el proteína con [α32-P] Incubar junto con NTP en presencia de MnCl2 como se describe en Materiales y Métodos.El análisis del producto de reacción indicó la presencia de una proteína radiomarcada que co-migra con nsp12 (106 kDa), lo que indica que el coronavirus nsp12 cataliza la formación de aductos proteína covalente-NMP, formados preferentemente con monofosfato de uridina (UMP) (Figura 1A) y B).El análisis cuantitativo mostró que, en comparación con otros nucleótidos, la intensidad de la señal de la incorporación de UMP aumentó de 2 a 3 veces (Figura 1C).Estos datos son consistentes con la actividad NMP transferasa prevista del dominio NiRAN del coronavirus (16), pero indican que las preferencias de nucleótidos del dominio NiRAN del coronavirus y del virus arterial son diferentes.
Actividad de autoNMPilación de HCoV-229E nsp12.(A) Se incubó HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) con el NTP [α-32P] designado en presencia de MnCl2 6 mM durante 30 minutos (consulte Materiales y métodos para obtener más detalles).Los productos de la reacción se separaron mediante SDS-PAGE y se tiñeron con azul brillante de Coomassie.(B) La proteína radiomarcada se visualiza mediante imágenes de fósforo.Las posiciones de nsp12-His6 y los marcadores de masa molecular de proteínas (en kilodaltons) se muestran en A y B. (C) La intensidad de la señal radiactiva (media ± SEM) se determinó a partir de tres experimentos independientes.*P≤0,05.La intensidad de la señal (porcentaje) está relacionada con UTP.
Aunque se ha demostrado que las actividades enzimáticas relacionadas con NiRAN son esenciales para la replicación de EAV y SARS-CoV en cultivos celulares (16), aún no se han determinado la función específica de NiRAN y sus posibles objetivos.La similitud estructural recientemente reportada entre NiRAN y una familia de proteínas con pliegues similares a la proteína quinasa (17, 22) nos llevó a probar la hipótesis de que NiRAN cataliza la NMPilación de otras proteínas.Generamos un conjunto de objetivos homólogos potenciales, incluidas proteínas no estructurales codificadas por HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), cada una de las cuales contiene una etiqueta His6 C-terminal (apéndice SI, Tabla S1), y Incubar estas proteínas con trifosfato de uridina [α32-P] ([α32-P]UTP) en presencia o ausencia de nsp12.La albúmina sérica bovina y la proteína de fusión MBP-LacZα producida en E. coli sirvieron como controles (Figura 2A, carriles 1 a 7).La proteína radiomarcada se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y autorradiografía, y se descubrió que había una fuerte señal radiactiva en la reacción que contenía nsp12 y nsp9.La posición de la señal corresponde a la masa molecular de nsp9, lo que indica la UMPilación de nsp9 mediada por nsp12 (Figura 2B, pista 7).No se encontró que ninguna otra proteína de prueba estuviera UMPilada, lo que nos llevó a concluir que nsp9 es un sustrato específico de nsp12.De acuerdo con los datos de autoNMPilación que se muestran en la Figura 1, nsp12 es capaz de transferir las cuatro NMP a nsp9, aunque la eficiencia es diferente, UMP> monofosfato de adenosina (AMP)> monofosfato de guanosina (GMP)> monofosfato de citidina (CMP)) ( Imagen).3A y B).Bajo las condiciones utilizadas en este ensayo (acortar el tiempo de reacción y exposición, reducir la concentración de nsp12; materiales y métodos), no se pudo detectar la autoNMPilación de nsp12 (compárese la Figura 2B, carril 7 y Figura 1B), lo que demostró ser un UMP eficaz (y de múltiples rondas) que pasó de nsp12 a nsp9.La actividad de la UMP transferasa requiere la presencia de iones Mn2+, como se muestra en la Figura 3C, mientras que solo se observó una actividad mínima de la UMP transferasa en presencia de Mg2+ y ninguna actividad en presencia de los otros dos cationes divalentes probados.Se obtuvieron datos similares en ensayos de NMPilación que contienen trifosfato de citidina (CTP), trifosfato de guanosina (GTP) y trifosfato de adenosina (ATP) (apéndice SI, Figura S1).
UMPilación de nsp9 mediada por HCoV-229E nsp12.Se utilizó una serie de sustratos proteicos (incluida la albúmina sérica bovina, MBP-lacZα y una serie de nsp HCoV-229E marcadas con His6 C-terminal codificada por ORF1a) para evaluar la actividad de UMPilación de HCoV-229E mediada por nsp12-His6⁺. proteína.Incubar la proteína con [α-32P] UTP durante 10 minutos en ausencia (A) o presencia (B) de nsp12 como se describe en los materiales y métodos.En la parte superior de A y B, se muestra el gel de SDS-poliacrilamida teñido con Coomassie Brilliant Blue, y en la parte inferior de A y B, se muestran los autorradiogramas correspondientes.La posición del marcador de masa molecular de la proteína (en kilodaltons) se muestra a la izquierda.También se indican la posición de nsp12-His6 (B, arriba) y la señal radiactiva observada durante la incubación de nsp12-His6 con nsp9-His6 (B, carril 7), lo que indica que [α-32P]UMP a nsp9-His6 (12,9 kDa), lo que no se observó con otras proteínas analizadas.
Caracterización bioquímica y virológica de la NMPilación de nsp9 mediada por HCoV-229E NiRAN.(A y B) El papel del cosustrato de nucleótido utilizado en la reacción.Nsp12-His6 y nsp9-His6 se mezclan y se incuban en presencia de diferentes NTP [α-32P] en el ensayo de NMPilación estándar.(A, arriba) nsp9-His6 teñido con Coomassie separado por SDS-PAGE.(A, abajo) Autorradiografía de la misma zona del gel.(B) La actividad relativa (media ± SEM) en presencia del cofactor de nucleótido designado se determina a partir de tres experimentos independientes.*P≤0,05.(C) El papel de los iones metálicos.Se muestra la prueba de NMPilación estándar en presencia de [α-32P] UTP y diferentes iones metálicos, cada uno con una concentración de 1 mM.En C, arriba, se muestra nsp9-His6 teñido con Coomassie, y en C, abajo, se muestra la autorradiografía correspondiente.El tamaño de la proteína marcada (en kilodaltons) se muestra a la izquierda de A y C. (D) La forma mutante de HCoV-229E nsp12-His6 que lleva la sustitución de aminoácidos especificada está en [α-32P]UTP, como se describe en Materiales y Métodos.La nsp9-His6 radiomarcada producida en la reacción de NMPilación se detecta mediante imágenes de fosforilación (D, arriba).La actividad relativa en comparación con la proteína de tipo salvaje (wt) se muestra en D, y la parte inferior se toma como el promedio (±SEM) de tres experimentos independientes.Los asteriscos indican sustituciones de residuos no conservados.(E) El título de virus en el sobrenadante del cultivo de células p1 obtenido 24 horas después de la infección se determinó mediante ensayo de placa.Se indican las sustituciones de codones en el dominio NiRAN del mutante HCoV-229E modificado (la numeración de los residuos se basa en su posición en pp1ab).El mutante del sitio activo RdRp deficiente en replicación nsp12_DD4823/4AA se utilizó como control.
Para obtener una comprensión más profunda del sitio activo de NiRAN y determinar los residuos relacionados con la actividad de la NMP transferasa específica de nsp9, realizamos un análisis de mutaciones, en el que reemplazamos los residuos conservadores en los motivos NiRAN AN, BN y CN ( 16) Es Ala (apéndice SI, Figura S2).Además, se evaluó en dos casos el impacto de las sustituciones conservadoras de Arg a Lys o de Lys a Arg.Como control (negativo), los residuos que no están o están menos conservados en el dominio NiRAN de los coronavirus y otros virus anidados se reemplazan con Ala. Reemplazando K4116A (en motivo preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motivo BN) y D4280A (CN) reducen significativamente o incluso eliminan la NMPilación de nsp9 a través de nsp12, mientras que las proteínas con sustituciones conservadoras (R4178K, K4116R) retienen el 60% y el 80% de su actividad, lo que indica que la relajación de las restricciones en sus respectivos lados cadenas es fisicoquímicamente sensible (Figura 3D).Reemplazar varios otros residuos conservados E4145A, D4273A, F4281A y D4283A es mucho menos dañino y la UMPilación de nsp9 solo se reduce moderadamente.Se obtuvieron resultados similares en reacciones de NMPilación de nsp9 que involucran otros NTP (Figura 3D y apéndice SI, Figura S3), lo que confirma que los efectos observados en las sustituciones de aminoácidos específicos son independientes del tipo de cosustrato de nucleótido utilizado.A continuación, probamos el posible impacto de estas sustituciones de nsp12 en la replicación de coronavirus en cultivo celular.Con este fin, utilizamos plantillas de ADN complementario (ADNc) genéticamente modificadas apropiadas clonadas en virus vaccinia recombinante (23, 24) para transcribir 5-7 células.La titulación de la progenie de virus infecciosos producida en estas células mostró que la mayoría de los mutantes NiRAN HCoV-229E no eran factibles (Figura 3E).Un grupo de mutantes virales no viables incluye alternativas que han demostrado eliminar o reducir significativamente la actividad de la NMP transferasa in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), pero existen otras dos alternativas (K4116R, E4145A) 80 % reservado?Su actividad de NMPilación in vitro sugiere que existen restricciones adicionales.De manera similar, otras dos mutaciones (R4178K, F4281A) que causaron una disminución moderada en la actividad de NMPilación in vitro de NiRAN produjeron virus vivos; sin embargo, estos virus redujeron significativamente los títulos durante la replicación.De acuerdo con los datos de actividad in vitro mostrados en la Figura 3D, la sustitución de otros cuatro residuos que no se conservan en el coronavirus y/u otros virus anidados (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) produjo virus viables. La descendencia, a pesar de tener un título moderadamente reducido en comparación con el virus de tipo salvaje (Figura 3E).
Para estudiar si la actividad de la NMP transferasa mediada por NiRAN depende del dominio RdRp activo, los dos residuos Asp conservados implicados en la coordinación de iones metálicos divalentes (11) en el motivo C RdRp fueron reemplazados por Ala. La proteína resultante nsp12_DD4823/4AA conserva su actividad de NMPilación de nsp9, lo que indica que la actividad de NMPilación de nsp9 in vitro mediada por nsp12 no requiere actividad polimerasa (Apéndice SI, Figura S4).
Después de establecer la actividad NMP transferasa específica de nsp9 para nsp12, intentamos caracterizar el aducto NMP-nsp9 mediante espectrometría de masas (MS).El espectro de masas proteico completo de HCoV-229E nsp9 recombinante mostró un pico a 12.045 Da (Figura 4A).La adición de nsp12 no cambió la calidad de nsp9, lo que indica que nsp12 y nsp9 no formarían un complejo estable en las condiciones utilizadas (desnaturalización) (Figura 4A).En presencia de UTP y GTP, la medición de masa de la reacción que contiene nsp9 y nsp12 respectivamente mostró que la masa proteica de UTP se movió 306 Da, y la masa proteica de GTP se movió 345 Da, lo que indica que cada molécula de nsp9 se une a una UMP o GMP. (Foto 4) C y D).Se especula que la energía necesaria para la NMPilación de nsp9 mediada por NiRAN proviene de la hidrólisis de NTP y la liberación de pirofosfato.Aunque en esta reacción se usó un exceso molar de 10 veces de nsp9 (objetivo) que de nsp12 (enzima), se observó una NMPilación casi completa de nsp9, lo que indica que la interacción entre nsp12 y nsp9 es de corta duración, y nsp12 puede NMPilar más nsp9. Molécula in vitro.
NMPilación única de nsp9 en presencia de nsp12 y UTP o GTP.Se muestra el espectro de masas proteico completo desconvolucionado de HCoV-229E nsp9 (apéndice SI, Tabla S1) (AD).(A) nsp9 solo, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 en presencia de UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 en presencia de GTP.
Para determinar los residuos de nsp9 UMPilados por nsp12, se escindió nsp9-UMP con tripsina.Los péptidos resultantes se separaron mediante cromatografía líquida de nanoalta resolución (HPLC) y se analizaron mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS) en línea.El análisis de datos utilizando el paquete de software Byonic (Protein Metrics) mostró UMPilación del aminoácido N-terminal.Esto se confirma manualmente.El espectro de masas en tándem del péptido precursor [UMP]NNEIMPGK (apéndice SI, Figura S5A) reveló un fragmento a 421 m/z, lo que indica que UMP se une al residuo 1 de nsp9.
En el extremo N de nsp9, Asn se conserva entre los miembros de Orthocoronavirinae (apéndice SI, Figura S6).Aunque creemos que el nitrógeno de la amina primaria N-terminal es el aceptor más probable de UMP, decidimos obtener evidencia adicional de la unión de NMP en el N-terminal.Por esta razón, el péptido N-terminal nsp9 no NMPilado y NMPilado purificado por HPLC se derivó en presencia de acetona y cianoborohidruro de sodio.En estas condiciones, sólo las aminas primarias libres pueden modificarse con propilo (25).El péptido N-terminal derivado de nsp9 con la secuencia NNEIMPGK contiene dos aminas primarias, una en el extremo N de Asn y la otra en la cadena lateral de Lys en el extremo C.Por tanto, se pueden introducir grupos propilo en ambos extremos.Los cromatogramas de iones extraídos de péptidos no NMPilados se muestran en el apéndice SI, Figura S5B.Como se esperaba, se pueden identificar péptidos (mono)propilados N-terminales y C-terminales (apéndice SI, Figura S5B, carril superior) y dipropilados (apéndice SI, Figura S5B, carril inferior).Este patrón cambia con el uso del péptido N-terminal NMPilado de nsp9.En este caso, solo se pueden identificar los péptidos propilados C-terminales, pero no se identifican los péptidos propilados N-terminales ni los péptidos dipropilados (Apéndice SI, Figura S5C), lo que indica que UMP se ha transferido a la amina primaria N-terminal para evitar esto. grupo de hacer cambios.
A continuación, reemplazamos (con Ala o Ser) o eliminamos los residuos conservados en el extremo N de nsp9 para definir restricciones específicas del objetivo.Según nuestros datos de EM que muestran que NiRAN forma un aducto de nsp9-NMP con la amina primaria del residuo N-terminal de nsp9, planteamos la hipótesis de que la NMPilación de nsp9 requiere la proteasa maestra viral (Mpro, nsp5) para liberar el N-terminal de nsp9 de su precursor poliproteico.Para probar esta hipótesis, produjimos una proteína precursora nsp7-11 que contiene nsp9 en E. coli y realizamos una prueba de NMPilación estándar en presencia de [α-32P] UTP (materiales y métodos).Como se muestra en la Figura 5A (carril 3), el precursor de nsp7-11 sin cortar no está radiomarcado con nsp12.Por el contrario, si nsp7-11 es escindida por nsp5 recombinante para liberar nsp9 (y otras nsp) del precursor, se detecta una proteína radiomarcada que migra con nsp9, lo que confirma nuestra conclusión de que NiRAN y N-formación selectiva de aductos covalentes de nsp9-NMP .La amina primaria terminal de la Asn N-terminal (posición 3825 en pp1a/pp1ab).Esta conclusión también está respaldada por experimentos que utilizan la construcción nsp9, que contiene uno o dos residuos adicionales en el extremo N.En ambos casos, se abolió la UMPilación de nsp9 mediada por NiRAN (Apéndice SI, Figura S7).A continuación, produjimos una proteína con uno o dos residuos de Asn eliminados de la secuencia peptídica 3825-NNEIMPK-3832 en el extremo N de nsp9.En ambos casos, la UMPilación de nsp9 se bloqueó completamente (Figura 5B), lo que proporciona evidencia adicional de que el extremo N de nsp9 real actúa como un receptor de NMP.
El procesamiento proteolítico de nsp9 y el papel de los residuos N-terminales en la UMPilación mediada por nsp12.(A) La UMPilación de nsp9 requiere un terminal N de nsp9 libre.Nsp7-11-His6 se preincuba a 30 °C en un tampón de detección de NMPilación que contiene UTP en presencia o ausencia de Mpro recombinante (nsp5-His6).Después de 3 horas, inicie el ensayo de NMPilación agregando nsp12-His6 como se describe en Materiales y métodos.La reacción que contenía nsp5-His6 (carril 1) y nsp9-His6 (carril 2) se usó como control.Después de 10 minutos, se terminó la reacción y la mezcla de reacción se separó mediante SDS-PAGE.La proteína se tiñó con Coomassie Brilliant Blue (A, arriba).El precursor de Nsp7-11-His6 y el producto procesado resultante de la escisión mediada por nsp5-His6 se muestran a la derecha.Tenga en cuenta (debido a su pequeño tamaño) que nsp7 y nsp11-His6 no son detectables en este gel, y la reacción se complementa con nsp5-His6 (carriles 1 y 4; la posición de nsp5-His6 se indica con un círculo sólido) o nsp9-His6 (carril 2) contiene una pequeña cantidad de MBP (indicada por círculos abiertos) como impurezas residuales porque se expresan como proteínas de fusión de MBP (apéndice SI, Tabla S1).(B) La variante Nsp9-His6 carece de uno o dos residuos Asn N-terminales (numeración de residuos según la posición en pp1a/pp1ab) y se purifica e incuba con nsp12-His6 y [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE teñido con Coomassie se muestra en la parte superior, B, la autorradiografía correspondiente se muestra en la parte inferior.La posición del marcador de peso molecular (en kilodaltons) se muestra a la izquierda.(C) Los residuos conservados N-terminales de nsp9-His6 de HCoV-229E se reemplazaron con Ala o Ser, y se usó la misma cantidad de proteína en la reacción de UMPilación mediada por nsp12-His6.Los productos de la reacción se separaron mediante SDS-PAGE y se tiñeron con azul brillante de Coomassie (C, arriba), y se detectó nsp9-His6 radiomarcado mediante imágenes de fosforescencia (C, medio).Utilizando proteína de tipo salvaje (wt) como referencia (establecida en 100%), se calculó la actividad relativa de NMPilación (media ± SEM) a partir de tres experimentos independientes.(D) Los títulos de virus en el sobrenadante del cultivo de células p1 de células Huh-7 infectadas con células Huh-7 de tipo salvaje HCoV-229E y los mutantes que portaban sustituciones de aminoácidos designadas en nsp9 se determinaron mediante ensayo de placa.El doble mutante DD4823/4AA del motivo C RdRp deficiente en replicación se utilizó como control negativo.
El extremo N de nsp9 (especialmente las posiciones 1, 2, 3 y 6) está muy conservado entre los miembros de la subfamilia Orthocoronavirinae (apéndice SI, Figura S6).Para estudiar el posible papel de estos residuos en la NMPilación de nsp9 mediada por nsp12, se reemplazaron dos residuos de Asn consecutivos en el extremo N de nsp9 con Ala o Ser (solos o en combinación).En comparación con nsp9 de tipo salvaje, reemplazar N3825 con Ala o Ser resultó en una reducción de más del doble en la UMPilación mediada por nsp12 (Figura 5C).De acuerdo con nuestra conclusión de que la NMPilación ocurre en la amina primaria N-terminal en lugar de en la cadena lateral del residuo N-terminal, observamos una NMPilación residual significativa con el reemplazo de N3825A y N3825S.Curiosamente, si el segundo Asn se reemplaza por Ala o Ser, la UMPilación de nsp9 se reduce con mayor fuerza (más de 10 veces), mientras que el reemplazo de Ala en las posiciones 3, 4 y 6 tiene solo un efecto moderado sobre la UMPilación de nsp9 (Figura 2). ).5C).Se obtuvieron resultados similares utilizando ATP, CTP o GTP (apéndice SI, Figura S8).En conjunto, estos datos indican el papel clave de N2826 (posición 2 en nsp9) en la NMPilación de nsp9.
Para obtener evidencia adicional de la correlación funcional entre el extremo N de nsp9 y la NMPilación, realizamos un alineamiento de secuencia múltiple (MSA) de la secuencia nsp9 de la familia de coronavirus (que varía entre 104 y 113 residuos) (Apéndice SI, Figura S6).En total, en 47 especies (conocidas y supuestas) de 5 géneros de la subfamilia Orthocoronavirinae que infectan a diferentes mamíferos, aves y reptiles hospedadores, solo se encontró que 8 residuos en total eran invariantes.Los cambios más extensos, incluidas eliminaciones e inserciones, se observaron en los ciclos entre los elementos de la estructura secundaria de nsp9, según lo determinado por estudios estructurales previos (26? 28).Se encontraron cinco residuos invariantes en la cadena β y la hélice α de la parte C-terminal de nsp9.Tres residuos invariantes constituyen el motivo NNE del extremo N de nsp9.Se revela que el segundo Asn de este motivo es el único residuo invariante, que también es compartido por el hipotético nsp9 del coronavirus de rana emparentado lejanamente, y representa la especie Microhyla letovirus 1 en la subfamilia Letovirinae de Alphaletovirus.La conservación de residuos en elementos de la estructura secundaria de nsp9 puede racionalizarse mediante consideraciones estructurales para mantener el plegamiento o las propiedades conocidas de unión al ARN.Sin embargo, este razonamiento no parece aplicarse a la conservación de NNE y, antes de este estudio, la naturaleza de las limitaciones que limitan la variación de la secuencia de tripéptidos estaba completamente oscurecida.
Para determinar la importancia de la NMPilación de nsp9 y la conservación de NNE en la replicación del coronavirus, produjimos mutantes HCoV-229E, que llevan sustituciones simples o dobles de residuos N-terminales de nsp9, lo que indica que la NMPilación de nsp9 es dañina in vitro.Antes de comenzar, intentamos responder la pregunta de si estas sustituciones (cerca del sitio de escisión de nsp8|9) afectan el procesamiento proteolítico de la región pp1a C-terminal.Se produjo un conjunto de construcciones de poliproteína nsp7-11 que contenían las sustituciones correspondientes en el extremo N de nsp9 en E. coli y se cortaron con Mpro recombinante.La escisión proteolítica de los cuatro sitios (incluido el sitio flanqueante de nsp9) no se ve afectada significativamente por ninguna sustitución introducida (apéndice SI, Figura S9), excluyendo los cambios estructurales en estas proteínas que interfieren con la escisión de nsp8 | 9 mediada por Mpro (u otra) sitio web.
Las células Huh-7 se transfectaron con ARN HCoV-229E de longitud genómica, que codifica sustituciones Ala o Ser en los tripéptidos NNE conservados (N3825, N3826 y E3827) en el extremo N de nsp9, lo que demuestra que la mayoría de las mutaciones son fatales.Pudimos rescatar el virus reemplazando la Ser o Ala del Asn N-terminal (N2835A o N2835S), pero no pudimos recuperar el virus con otras mutaciones simples y dobles en la secuencia NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figura 5D).
Estos resultados indican que la replicación de los coronavirus en cultivos de tejidos está restringida (igual o similar), lo que limita la mutación natural de los sitios de NMPilación de nsp9 en el cuerpo y respalda el papel clave de esta respuesta en el ciclo de vida de los coronavirus.
En el último conjunto de experimentos, produjimos nsp12 y nsp9 del SARS-CoV-2 marcado con His6 C-terminal, y dos formas mutantes de nsp12 en E. coli.Los residuos del sitio activo en los dominios NiRAN y RdRp se usaron respectivamente Ala en su lugar (Figura 6A y apéndice SI, Tabla S2).K4465 en SARS-CoV-2 nsp12 corresponde a K4135 en HCoV-229E (Apéndice SI, Figura S2), que resultó ser necesario para la actividad de NiRAN y la replicación de HCoV-229E (Figura 3D y E).Este residuo también corresponde al residuo K94 del virus arterial EAV nsp9, que previamente se demostró que era necesario para la auto-UMPilación/auto-GMPilación de NiRAN (16).Como se muestra en la Figura 6B, nsp12 del SARS-CoV-2 tiene actividad UMP transferasa utilizando nsp9 como sustrato, mientras que el mutante del sitio activo nsp12_K4465A está inactivo.La doble sustitución en la secuencia característica SDD del motivo C RdRp no afecta la actividad de la transferasa UMP (Figura 6B), lo que indica que la actividad RdRp no tiene un efecto directo en la UMPilación de nsp9.Se obtuvieron datos similares utilizando CTP, GTP y ATP (apéndice SI, Figura S10).En resumen, estos datos indican que la NMPilación de nsp9 mediada por NiRAN tiene una actividad conservadora en coronavirus que representan diferentes géneros de la subfamilia de ortocoronavirus.
NMPilación de nsp9 mediada por nsp12 del SARS-CoV-2.(A) Gel de poliacrilamida SDS teñido con Coomassie que muestra la proteína recombinante utilizada en la prueba de NMPilación.Como control, se utilizó una proteína mutante con sustitución de sitio activo en el dominio NiRAN (K4465A) y el dominio RdRp (DD5152/3AA) de SARS-CoV-2 nsp12.La numeración de los residuos se basa en la posición en pp1ab.(B) Autorradiografía de la detección de UMPilación utilizando nsp9-His6 y [α-32P]UTP como sustrato de nsp12-His6 (tipo salvaje [wt] y mutante).La masa molecular (en kilodaltons) de la proteína marcada se muestra a la izquierda.
Los dominios NiRAN generalmente se conservan en Nidovirales (16), lo que indica que catalizan reacciones enzimáticas esenciales para la replicación de Nidovirus.En este estudio pudimos demostrar que el dominio NiRAN del coronavirus transfiere NMP (generada a partir de NTP) a nsp9, una misteriosa proteína de unión a ARN implicada en la replicación del virus (26 ?? 29), para determinarla como un objetivo natural y socio de coronavirus RTC.
El dominio NiRAN comparte tres motivos de secuencia (AN, BN y CN), que contienen una cantidad muy pequeña de residuos que se conservan en todas las familias del orden Nidovirales, monofilético pero altamente diferenciado (8, 16).Estudios recientes han demostrado que están relacionados estructuralmente con una familia en gran medida no caracterizada de proteínas similares a la proteína quinasa, que originalmente se llamaron familia SelO (17, 19, 22, 30, 31).Las proteínas relacionadas con SelO tienen pliegues de quinasa, pero carecen de varios residuos de sitios activos conservados en las quinasas clásicas (22, 32).Basándose en la orientación inversa de las moléculas de ATP unidas al sitio activo y estabilizadas mediante interacciones específicas, se planteó la hipótesis y posteriormente se confirmó que SelO transfiere AMP (en lugar de fosfato) al sustrato proteico (22), mientras que otra proteína bacteriana similar a SelO, YdiU, tiene Recientemente se ha demostrado que cataliza la unión covalente de UMP a residuos Tyr y His de diferentes sustratos proteicos (33).
Para confirmar y ampliar la predicción de los supuestos residuos del sitio activo del dominio NiRAN del coronavirus, utilizamos métodos bioquímicos y de genética inversa para realizar análisis de mutaciones en el coronavirus nsp12 (Figura 3D y apéndice E y SI, Figura S3 y tabla) S1â S4).Los datos muestran que la sustitución de HCoV-229E K4135, R4178 y D4280 con Ala elimina la actividad NMP transferasa in vitro y la replicación del virus en cultivo celular (Figura 3D y apéndices E y SI, Figura S3), lo que respalda su presencia en NTP γ-fosfato. (K4135, R4178) y la coordinación de iones metálicos del sitio activo (D4280).Se demostró que la sustitución E4145A del Glu conservado en el rango del virus del nido de pájaro que se predijo para estabilizar la posición K4135 (17) elimina la replicación viral, pero sorprendentemente, la actividad se mantuvo en el ensayo de NMPilación in vitro (Figura 3D y E y Apéndice SI, Figura S3 y Tablas S1-S4).Se hizo una observación similar cuando se introdujo la sustitución correspondiente en el homólogo YdiU de Salmonella typhimurium (E130A) (33).En conjunto, estos datos respaldan la función reguladora de este residuo conservado en lugar de la función catalítica.
Reemplazar el residuo de Phe conservado (F4281A) dentro del rango de nestovirus en el dominio NiRAN HCoV-229E (8) resultó en una disminución de la actividad de NMPilación in vitro y una disminución significativa en la replicación del virus en cultivo celular (Figura 3D, E y SI) apéndice, Figura S3).Los datos son consistentes con la importante función reguladora de este residuo, como el residuo Phe del motivo DFG homólogo mostrado anteriormente.En las proteínas quinasas clásicas, es parte del bucle de unión de Mg2+ y ayuda a ensamblar y regular la columna vertebral.??Requerido para una actividad catalítica efectiva (32, 34).La sustitución de los residuos K4116 por Ala y Arg (en el motivo preAN), respectivamente, eliminó la replicación viral y, como se esperaba, tuvo diferentes efectos sobre la actividad de la NMP transferasa in vitro, dependiendo de la cadena lateral de aminoácidos introducida (Figura 3D y apéndices E y SI). , Figura S3).Los datos funcionales son consistentes con la información estructural, lo que indica que este residuo ha establecido una interacción con el ATP fosfato (17).En el dominio NiRAN de otras familias de virus anidados, la posición de HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 está ocupada por Lys, Arg o His (8), lo que indica que la restricción funcional de este residuo específico se ha relajado.La sustitución de D4188A y D4283A elimina o reduce fuertemente la actividad enzimática y elimina la replicación del virus (Figura 3).Estos dos residuos se conservan en la mayoría (pero no en todos) los virus anidados (8), lo que indica una importante función específica de la familia, pero posiblemente no catalítica.Se utilizaron como controles sustituciones Ala de varios otros residuos de Lys y Asp (K4113A, D4180A, D4197A y D4273A) que no se conservan en Coronaviridae u otras familias de Nestioviridae (8).Como se esperaba, estas sustituciones son en gran medida tolerables, con una ligera disminución en la actividad enzimática y la replicación viral en algunos casos (Figura 3 y apéndice SI, Figura S3).En general, los datos de mutagénesis del coronavirus son muy consistentes con los datos de auto-GMP y genética inversa de EAV NiRAN-RdRp (16), en los cuales el residuo K94 de EAV nsp9 (ortólogo de coronavirus nsp12) (correspondiente a HCoV-229E K4135) tiene funciones importantes). R124 (correspondiente a R4178), D132 (correspondiente a D4188), D165 (correspondiente a D4280), F166 (correspondiente a F4281).Además, los datos de mutagénesis de HCoV-229E son consistentes y se han ampliado a partir de los datos de genética inversa del SARS-CoV informados anteriormente (16), y son muy similares a los observados para el correspondiente motivo CN Phe-to-Ala mutante SARS-CoV_nsp12. fenotipo descrito -F219A y HCoV-229E_F4281A (Figura 3 D y E y apéndice SI, Figura S3 y Tabla S1-S4).
En comparación con los ortólogos de EAV (16), que tienen una clara preferencia por UTP y GTP (en la reacción de auto-NMPilación), nuestro estudio muestra que el dominio NiRAN del coronavirus (representado por HCoV-229E y SARS-CoV-2) puede ser eficaz. transfirieron los cuatro NMP, aunque hay una ligera preferencia por UMP (Figuras 1 y 3).La especificidad relativamente baja del cosustrato de NTP específico es consistente con la estructura supercompuesta del SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 recientemente reportada, en la que ADP-Mg2+ se une al sitio activo de NiRAN, pero no con la adenina. de la formación de interacciones específicas (17).En nuestro estudio, el tipo de nucleótido utilizado en la reacción de NMPilación no tiene ningún efecto diferencial sobre la actividad de la proteína mutante (Apéndice SI, Figura S3), lo que indica que ninguno de estos residuos está estrechamente relacionado con la unión de una nucleobase específica.Quedan por estudiarse la base estructural y la posible importancia biológica de las diferentes preferencias de cosustrato de NTP observadas en los dominios NiRAN de los coronavirus y los virus arteriales;pueden ser ciertos o pueden deberse a las limitaciones de sus respectivos estudios.En la actualidad, no se puede descartar que la posible actividad NMPylator del dominio NiRAN del virus arterial (en comparación con la actividad de autoNMPilación previamente caracterizada) tenga una preferencia de cosustrato diferente, teniendo en cuenta que la similitud entre el arterial y el coronavirus El dominio NiRAN está en su límite.Comparación basada en secuencias (16).En comparación con la pseudoquinasa SelO, que utiliza Mg2+ como cofactor, la actividad del coronavirus y del virus arterial NiRAN depende de Mn2+ (16) (Figura 3C y apéndice SI, Figura S1).La dependencia de Mn2+ y la preferencia obvia por UTP es una característica inusual de las proteínas NMPylators, y solo recientemente se ha confirmado en la proteína YdiU de Salmonella typhimurium, que cataliza la estricta UMPilación de la proteína chaperona dependiente de Mn2+ para proteger a las células de la inducción de estrés. 33).
La similitud estructural recientemente descrita entre el dominio NiRAN del coronavirus y las proteínas quinasas celulares (17, 19) brinda apoyo adicional a la capacidad de NiRAN para unir covalentemente NMP a otras proteínas que hemos informado en este estudio.Centramos nuestra búsqueda de posibles objetivos de NiRAN en las proteínas codificadas por HCoV-229E ORF1a, que se sabe que ayudan directa o indirectamente a la replicasa codificada por ORF1b de RTC (12, 35).Nuestros experimentos proporcionan evidencia concluyente de la NMPilación efectiva y específica de nsp9 (Figura 2).Si la proteína objetivo se utiliza en un exceso molar de 8 a 10 veces mayor que el de la enzima (nsp12), se confirma que nsp9 está completamente (mono)NMPizada (Figura 4).Concluimos que la interacción entre nsp12 y nsp9 es de corta duración y no formará un complejo estable con nsp9 (en ausencia de otras subunidades RTC).Esta conclusión está respaldada por estudios de interacción de proteínas en el proteoma del SARS-CoV (35).El análisis de EM identificó la amina primaria del residuo N-terminal de nsp9 como el sitio de NMPilación (apéndice SI, Figura S5).La formación del enlace fosforamidato y el grupo amino N-terminal distingue la actividad de NMPilación mediada por NiRAN de la reacción de AMPilación mediada por SelO de Pseudomonas syringae, que cataliza la formación de AMP O-ligado en los residuos de Ser, Thr o Tyr. Aducto peptídico ( 22), y S. typhimurium YdiU forma aductos péptido-UMP unidos a O (con Tyr) y unidos a N (con His).La información limitada disponible sobre la familia de proteínas SelO indica que los miembros de esta gran familia de proteínas difieren mucho en la formación de aductos péptido-NMP.Esta es una observación interesante que merece más estudio.
Los datos obtenidos en este estudio nos llevaron a plantear la hipótesis de que la NMPilación de nsp9 requiere un extremo N libre.En el contexto de la replicación viral, esto será proporcionado por la escisión proteolítica del sitio de procesamiento nsp8|nsp9 en la poliproteína replicasa pp1a mediada por Mpro y pp1ab.En la mayoría de los coronavirus, la diferencia entre este sitio específico (VKLQ|NNEI en HCoV-229E) y todos los demás sitios de escisión de Mpro del coronavirus es que Asn (en lugar de otro residuo pequeño, como Ala, Ser o Gly) ocupa P1â???Ubicación (36).Los datos de escisión de péptidos obtenidos en los primeros estudios mostraron que la eficiencia de escisión del sitio nsp8|nsp9 era menor que la de otros sitios, lo que indica que 1) este sitio específico puede tener un papel regulador en el procesamiento coordinado oportuno del C-terminal región pp1a, o 2) a El papel del extremo N especial conservado de nsp9 en la replicación del virus (37).Nuestros datos (Figura 5A) mostraron que la forma recombinante de nsp9 que lleva la secuencia N-terminal real fue NMPizada efectivamente por nsp12.La secuencia flanqueante N-terminal se eliminó mediante el factor Xa (nsp9-His6; apéndice SI, Tabla S1) o la escisión mediada por Mpro (nsp7-11-His6; Figura 5A y apéndice SI, Tabla S1).Es importante destacar que el precursor sin cortar que contiene nsp9, nsp7-11-His6, mostró resistencia a la NMPilación de nsp12, lo cual es consistente con nuestros datos, lo que indica que el aducto de nsp9-NMP se forma a través de la amina primaria N-terminal (apéndice SI, Figura S5). .Para obtener una comprensión más profunda de la especificidad del sustrato NiRAN, luego nos centramos en los residuos N-terminales adyacentes de nsp9.En ausencia de otras proteínas, son estructuralmente flexibles, lo que impide que se detecten en la forma no marcada de nsp9 (26, 28, 38), lo que indica su variación natural limitada. Esto se debe a la importante secuencia específica (no relacionada con la estructura secundaria) Función del fragmento N-terminal de nsp9.Las sustituciones Ala de residuos conservados en esta región (Figuras 5C y D y apéndice SI, Figura S8) revelan que N3826 es esencial para la NMPilación de nsp9 in vitro, mientras que las sustituciones N3825A y E3827A conducen a una disminución de la NMPilación, mientras que las sustituciones M3829A y P3830A no .Obviamente afecta la NMPilación de nsp9.Aunque la sustitución de Asn N-terminal (N3825A, N3825S) tiene solo un efecto moderado sobre la NMPilación de nsp9 y la replicación del virus en cultivo celular (Figura 5C y D), la eliminación de una secuencia de residuos de Asn del dipéptido N-terminal 3825-NN Se demostró que es letal para los virus, lo que indica que se requiere un residuo de Asn antes que otro residuo en el extremo N, preferiblemente Asn, aunque parece que la sustitución de residuos similares puede tolerarse parcialmente (Figura 5B, C y D).Concluimos que el dipéptido 3825-NN, especialmente el residuo N3826 conservado y esencial dentro del rango de coronavirus (apéndice SI, Figura S6), garantiza la unión y orientación correctas del extremo N de nsp9 en el sitio activo de NiRAN.
La sustitución de Ala (E3827A) por el Glu conservado de todas las subfamilias conserva la NMPilación de nsp9 in vitro pero es letal para los virus en cultivos celulares (Figura 5C y D), lo que indica la función adicional de este residuo, por ejemplo, en interacciones clave (NMPilado o no modificado). ) nsp9 N-terminal y otros factores implicados en la replicación del virus.Las mutaciones de Nsp9 no afectaron el proceso proteolítico de nsp9 ni de ningún nsp adyacente (39) (Apéndice SI, Figura S9), lo que indica que los fenotipos letales de varias mutaciones de nsp9 observadas no fueron causados por la desregulación del área pp1a terminal del proceso proteolítico C. .
Los datos anteriores proporcionan evidencia de que después del tratamiento mediado por Mpro del sitio de escisión de nsp8|9 en pp1a/pp1ab, el extremo N de nsp9 puede UMPilarse (o modificarse parcialmente con otra NMP).Además, la excelente conservación del extremo N de nsp9 (incluidos los residuos de Asn singulares e invariantes en la familia de los coronavirus) y los datos de genética inversa obtenidos en este estudio (Figuras 3E y 5D) nos llevaron a concluir que la NMPilación de nsp9 descrita está biológicamente relacionado y es esencial para la replicación del coronavirus.Las consecuencias funcionales de esta modificación aún están por estudiarse, por ejemplo, con respecto a la actividad de unión al ARN de nsp9 (forma no modificada) descrita anteriormente (2628).La NMPilación N-terminal también puede afectar la interacción de nsp9 con sustratos de proteínas o ARN o la formación de diferentes conjuntos de cuatro niveles.Estos se han observado en estudios estructurales y se ha confirmado que están funcionalmente relacionados con la replicación del coronavirus, aunque especialmente en ausencia de esta modificación (26-ââ29, 40).
Aunque aún es necesario caracterizar con más detalle la especificidad objetivo del dominio NiRAN del coronavirus, nuestros datos muestran que la especificidad objetivo de la proteína del dominio NiRAN del coronavirus es muy estrecha.Aunque la conservación de los residuos clave del sitio activo (8, 16) en el dominio NiRAN de todas las familias de nidovirus respalda firmemente la actividad del NMPylator conservado de estas proteínas, la identidad de los residuos de la bolsa de unión al sustrato de este dominio aún no se ha caracterizado. , y puede diferir entre diferentes familias de Nidovirales propósitos.Del mismo modo, aún no se han determinado los objetivos relevantes de otros virus anidados.Pueden ser ortólogos remotos de nsp9 u otras proteínas, porque las secuencias fuera de los cinco dominios de replicasa que generalmente se conservan en los virus anidados están menos conservadas (8), incluida la matriz genómica entre Mpro y NiRAN. Entre ellas, nsp9 se encuentra en la coronavirus.
Además, actualmente no podemos descartar la posibilidad de que el dominio NiRAN tenga objetivos adicionales (incluidos los celulares).En este caso, vale la pena mencionar que los homólogos bacterianos en esta proteína emergente NMPylators (NMPylators) (30, 31) parecen tener “reguladores maestros”.La NMP modula una variedad de proteínas celulares para regular o eliminar sus actividades posteriores, desempeñando así un papel en una variedad de procesos biológicos, como la respuesta al estrés celular y la homeostasis redox (22, 33).
En este estudio (Figuras 2 y 4 y Apéndice SI, Figuras S3 y S5), pudimos demostrar que nsp12 transfirió la parte UMP (NMP) a una posición única (conservada) en nsp9, mientras que otras proteínas no se modificaron en el utilizado Bajo las condiciones, se admite una especificidad de sustrato bien definida (en lugar de suelta).De acuerdo con esto, en comparación con la NMPilación de nsp9 N-terminal, la propia actividad de NMPilación de nsp12 es muy baja, su detección requiere un tiempo de exposición a la autorradiografía más prolongado y se utiliza un aumento de 10 veces en la concentración de nsp12.Además, nuestro análisis de EM no logró proporcionar evidencia de la NMPilación de nsp12, lo que sugiere que la autoNMPilación del dominio NiRAN es (en el mejor de los casos) una actividad secundaria.Sin embargo, cabe señalar que otros estudios han proporcionado evidencia preliminar de que el estado de autoAMPilación del NMPylator bacteriano puede controlar su actividad de NMPilación en otros sustratos proteicos (22, 33).Por lo tanto, se necesita más investigación para investigar los posibles efectos funcionales de las actividades de autoNMPilación reportadas para EAV nsp9 (16) y coronavirus nsp12 (este estudio), incluido el efecto similar a la chaperona propuesto en el plegamiento del dominio RdRp C-terminal ( dieciséis) ).
Anteriormente, se han considerado varias hipótesis sobre las posibles funciones posteriores del dominio NiRAN nidoviral, incluida la ARN ligasa, la guanilato transferasa cubierta por ARN y la actividad de cebado de proteínas (16), pero ninguna de ellas es compatible con las funciones posteriores disponibles.La información obtenida en las siguientes posiciones es exactamente la misma sin hacer suposiciones adicionales.Los datos obtenidos en este estudio son más consistentes con (pero no pueden probar) que el dominio NiRAN está involucrado en el inicio de la síntesis de ARN inducida por proteínas.Anteriormente se creía que la función del dominio NiRAN en 5??Las reacciones de limitación o ligadura de ARN de ²-ARN no se ven afectadas por estos y respaldan otros datos.Por lo tanto, por ejemplo, se considera que el sitio activo de NiRAN involucra al Asp conservado como base general (D252 en Pseudomonas syringae SelO; D4271 en HCoV-229E pp1ab; D208 en SARS-CoV-2 nsp12) (Apéndice SI, figura 2 ).S2) (17, 22, 33), mientras que la catálisis en la ARN ligasa dependiente de ATP y la enzima bloqueadora de ARN se lleva a cabo mediante la enzima covalente-(lisil-N)-NMP intermedia, que implica un residuo de Lys no modificado ( 41).Además, la notable especificidad basada en secuencia del coronavirus NiRAN por dianas proteicas conservadas y la especificidad relajada por los cosustratos de NTP (prefiere UTP) se oponen a las funciones similares a la enzima limitadora mediada por NiRAN o a la ARN ligasa.
Obviamente, se necesita mucho trabajo adicional para verificar y, si se demuestra, desarrollar el posible papel de nsp9-UMP (nsp9-NMP) en la síntesis de ARN inducida por proteínas, lo que conectará varios informes interesantes pero (hasta ahora) informados anteriormente. .Observaciones aisladas.Por ejemplo, se ha determinado que el final de la cadena negativa de ARN del coronavirus comienza con una cadena oligo(U) (42, 43).Esta observación es consistente con la idea de que la síntesis de ARN de cadena negativa se inicia mediante la unión de la forma UMPilada de nsp9 a la cola poli(A) (desencadenantes), que puede ser promovida por su unión al ARN. La actividad y/o interacción con otra proteína RTC.La porción UMP proporcionada por nsp9 se puede usar luego como "cebador" para la oligouridilación mediada por nsp7/8/nsp12, usando la cola 3??²-poli(A) en el ARN genómico u otra secuencia que contiene oligo (A). sirve como plantilla, similar al mecanismo establecido para la proteína VPg del picornavirus (44).¿Qué pasa si la propuesta es “no normativa”????El inicio de la síntesis de ARN de cadena negativa (inducida por proteínas) proporciona un vínculo con las observaciones, lo que indica que el ARN de cadena negativa del coronavirus tiene UMP (en lugar de UTP) en su extremo (42), lo que se considera que indica que la El ácido nucleico Dicer escinde el extremo fosforilado por una endonucleasa desconocida específica de uridina.Si se confirma, esta actividad hidrolítica del ácido nucleico puede ayudar a liberar la forma oligomérica UMPilada de nsp9 del extremo 5² de la cadena negativa naciente.El posible papel de nsp9 en el cebado de proteínas también es consistente con estudios previos de genética inversa, que han demostrado que nsp9 (y nsp8) interactúan de manera crítica y específica con el elemento de ARN conservado que actúa en cis cerca del extremo 3 del genoma del coronavirus.45).Según este informe, estas observaciones previas ahora pueden reexaminarse y ampliarse mediante más investigaciones.
En resumen, nuestros datos determinaron la actividad específica de una etiqueta enzimática de virus anidada patentada vinculada a RdRp en el extremo N.En el coronavirus, esta actividad UMPylator/NMPylator mediada por NiRAN recientemente descubierta se utiliza para depender de Mn2+ y los residuos de Asn adyacentes y provocar la formación de enlaces fosforamidato (de baja energía) con la amina primaria N-terminal.A través de la escisión mediada por Mpro en el sitio de escisión de nsp8|9, el objetivo de nsp9 se puede utilizar para la NMPilación, lo que indica el acoplamiento funcional entre la proteasa y el dominio NiRAN, que se extiende hasta RdRp.La conservación de residuos clave en el sitio activo de nsp12 NiRAN y el objetivo de nsp9, combinada con datos obtenidos de dos coronavirus, incluido el SARS-CoV-2, proporciona pruebas sólidas de que la NMPilación de nsp9 es un coronavirus. Las características conservadoras también son un paso clave en la replicación del virus.Los datos disponibles nos llevan a concluir que el papel específico de la forma NMPilada de nsp9 en la síntesis de ARN inducida por proteínas es un escenario razonable para el coronavirus y otros virus anidados, y que NiRAN también puede apuntar a otras proteínas no identificadas.Regular el virus.Interacción con el anfitrión.Si se confirma, la participación de cebadores proteicos en la síntesis de ARN viral aumentará la afinidad de secuencia de los dominios Mpro/3CLpro y RdRp entre el coronavirus previamente detectado y el supergrupo similar a picornavirus (9), que ahora se han unificado en los pisoniviritos recientemente establecidos. 46) en la categoría.
Nuestros datos también muestran que las actividades enzimáticas básicas, selectivas y conservadoras identificadas en este estudio pueden usarse como objetivos para medicamentos antivirales.Los compuestos que interfieren con la unión (y posterior modificación) del extremo N conservado de nsp9 en el sitio activo de NiRAN pueden convertirse en fármacos antivirales eficaces y versátiles, adecuados para el tratamiento de coronavirus animales y humanos de diferentes (sub)géneros de infecciones. , incluido el SARS-CoV-2 y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio.
La secuencia codificante de la proteína del coronavirus producida en este estudio se amplificó mediante RT-PCR utilizando ARN aislado de Huh-7 infectado con HCoV-229E o Vero E6 infectado con SARS-CoV-2, y se insertó mediante procedimientos de clonación estándar.Vector de expresión pMAL-c2 (Laboratorio Biológico de Nueva Inglaterra) o pASK3-Ub-CHis6 (47) (Apéndice SI, Tablas S1 y S2).Se introdujeron sustituciones de codones únicos mediante mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR (48).Para producir la proteína de fusión MBP, se transformaron células TB1 de E. coli con la construcción de plásmido pMAL-c2 apropiada (apéndice SI, Tabla S1).La proteína de fusión se purificó mediante cromatografía de afinidad por amilosa y se escindió con factor Xa.Posteriormente, la proteína C-terminal marcada con His6 se purificó mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados con Ni (Ni-IMAC) como se describió anteriormente (49).Para producir la proteína de fusión de ubiquitina, las células TB1 de E. coli utilizaron la construcción de plásmido pASK3-Ub-CHis6 apropiada (Apéndice SI, Tablas S1 y S2) y el ADN del plásmido pCGI que codifica la hidrolasa C-terminal 1 específica de ubiquitina (Ubp1).Transformación (47).La proteína del coronavirus marcada con His6 C-terminal se purificó como se describió anteriormente (50).
La prueba de autoNMPilación de HCoV-229E nsp12-His6 se realizó como se describe en EAV nsp9 (16).En resumen, nsp12-His6 (0,5 µM) contiene ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES)-KOH 50 mM, pH 8,0, ditiotreitol (DTT) 5 mM, MnCl2 6 mM, tampón 25 µM, incubar. el NTP especificado y 0,17 µM coincidieron con [α32-P]NTP (3000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) a 30 °C durante 30 minutos.En todos los demás ensayos de NMPilación (estándar) de NMPilación de nsp9 mediada por nsp12, las condiciones de reacción se ajustan de la siguiente manera: nsp12-His6 (0,05 µM) y nsp9-His6 (4 µM) en presencia de HEPES-KOH 50 mM (pH 8,0). ), DTT 5 mM, MnCl2 1 mM, NTP indicado 25 µM y [α32-P]NTP coincidente 0,17 µM.Después de incubar durante 10 minutos a 30 °C, la muestra de reacción se mezcló con tampón de muestra SDS-PAGE: tris(hidroximetil)aminometano HCl 62,5 mM (pH 6,8), DTT 100 mM, SDS al 2,5 %, glicerol al 10 % y bromofenol al 0,005 %. azul.La proteína se desnaturalizó calentando a 90 °C durante 5 minutos y se separó mediante SDS-PAGE al 12 %.El gel se fija y se tiñe con una solución de Coomassie Brilliant Blue (40 % de metanol, 10 % de ácido acético, 0,05 % de Coomassie Brilliant Blue R-250), se decolora y se expone a una pantalla de imágenes fosforescente durante 20 horas (para detectar nsp12 a partir de NMPilación). o (máximo) 2 horas (para evaluar la NMPilación de nsp9).Se utilizó un generador de imágenes Typhoon 9200 (GE Healthcare) para escanear la pantalla y ImageJ para analizar la intensidad de la señal.
Para el análisis de MS, se usaron nsp12-His6 1 µM y nsp9 10 µM (sin etiqueta de hexahistidina) en el análisis de NMPilación (apéndice SI, Tabla S1) y se usó la concentración aumentada de UTP y GTP 500 µM.Dependiendo de su concentración y calidad de proteína esperada, se utilizó un sistema HPLC Waters ACQUITY H-Class equipado con una columna MassPrep (Waters) para desalar en línea de 1 a 10 µL de soluciones de proteínas tamponadas.La proteína desalada se eluye en la fuente de iones por electropulverización del espectrómetro de masas Synapt G2Si (Waters) a través del siguiente gradiente de tampón A (agua/0,05 % de ácido fórmico) y tampón B (acetonitrilo/0,045 % de ácido fórmico), y la temperatura de la columna es 60 °C y un caudal de 0,1 ml/min: elución isocrática con 5 % de A durante 2 minutos, luego un gradiente lineal hasta 95 % de B en 8 minutos y mantener 95 % de B durante otros 4 minutos.
Se detectan iones positivos con un rango de masa de 500 a 5000 m/z.El glufibrinopéptido B se mide cada 45 segundos para la corrección automática de la deriva de masa.Utilice el software del instrumento MassLynx con la extensión MaxEnt1 para desconvolucionar el espectro promedio después de deducir la línea base y suavizar.
La nsp9 HCoV-229E UMPilada se digirió añadiendo tripsina modificada de grado de secuenciación (Serva) y se incubó durante la noche a 37 °C.Se usó una columna de centrifugación Chromabond C18WP (número de pieza 730522; Macherey-Nagel) para desalar y concentrar los péptidos.Finalmente, el péptido se disolvió en 25 µL de agua, que contenía 5% de acetonitrilo y 0,1% de ácido fórmico.
Las muestras fueron analizadas por EM utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).El último sistema nanoâ HPLC (Dionex), equipado con un cabezal personalizado de 50 cm montado en el extremo.Columna C18 RP de 75 μm repleta de perlas magnéticas de 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Conéctese al espectrómetro de masas en línea a través de la fuente de nanopulverización Proxeon;Inyecte 6 µL de solución de digestión con tripsina en un diámetro interior de 300 µm ×??Columna de preconcentración PepMap C18 de 1 cm (Thermo Scientific).Utilizando agua/ácido fórmico al 0,05 % como disolvente, la muestra se atrapó y desalinizó automáticamente a un caudal de 6 µl/min.
Se utilizaron los siguientes gradientes de agua/ácido fórmico al 0,05% (disolvente A) y 80% de acetonitrilo/ácido fórmico al 0,045% (disolvente B) para lograr la separación de péptidos trípticos a un caudal de 300 nL/min: 4% B para 5 minutos, luego un gradiente lineal de 30 A hasta un 45 % de B en cuestión de minutos, y un aumento lineal hasta un 95 % de disolvente B en 5 minutos.Conecte la columna cromatográfica a un nanoemisor de acero inoxidable (Proxeon) y rocíe el eluyente directamente al capilar calentado del espectrómetro de masas utilizando un potencial de 2300 V. El escaneo de encuesta con una resolución de 60 000 en el analizador de masas Orbitrap está asociado con al menos tres escaneos de MS/MS de datos, excluidos dinámicamente durante 30 segundos, utilizando disociación inducida por colisión de trampa de iones lineal o disociación de colisión de mayor energía combinada con detección de orbitrap, la resolución es 7500.
Hora de publicación: 03-ago-2021